Denumirea proiectului: Identificarea de noi inhibitori de colagenază bacteriană ca medicamente antivirulență

Contract Nr.: PD 184/2020

Cod Proiect: PN-III-P1-1.1-PD-2019-0646

Tip proiect: PN-III-P1-1.1-PD (Proiecte de Cercetare Postdoctorală)

Finanțare de la bugetul de stat: 236.966 lei

Durata de desfășurare proiect: 01.09.2020 - 15.11.2022 (26 luni și 2 săptămâni)

Echipa de cercetare:

Director proiect: Dr. Georgiana Nițulescu, Conferențiar la Disciplina Tehnologie farmaceutică și Biofarmacie, Facultatea de Farmacie, UMF Carol Davila

Mentor: Dr. Daniela Grădinaru, Profesor universitar la Disciplina Biochimie, Facultatea de Farmacie, UMF Carol Davila

Obiectivul proiectului: Identificarea unor inhibitori ai colagenazelor bacteriene, enzime implicate în virulența tulpinilor de Clostridium, P.aeruginosa, precum și a altor bacterii capabile să secrete aceste enzime. Acești inhibitori reprezintă posibile soluții terapeutice pentru tratamentul infecțiilor nosocomiale cu agenți patogeni foarte rezistenți.

Metodologie și plan de lucru:

Etapa I (01.09.2020 – 31.12.2020): Identificarea profilului molecular al inhibitorului enzimatic cu ajutorul tehnicilor moderne de cercetare a medicamentului precum screening virtual.

Etapa II (01.01.2021 – 31.12.2021): Validarea compușilor ca inhibitori eficienți ai anti-colagenazei prin studii de docking molecular și determinarea in vitro a inhibiției enzimatice. Studii de evaluare toxicologică a compușilor.

Etapa III (01.01.2022 – 15.11.2022): Determinarea CI₅₀ asupra colagenazei a unor compuși și evaluarea inhibitoare a colagenazei în culturile bacteriene.

Rezultate estimate: Identificarea profilului structural optim al inhibitorilor de colagenază bacteriană dar și evidențierea efectului de inhibiție al colagenazei bacteriene pentru diverși compuși testați. În această direcție este avută în vedere publicarea a cel puțin două articole științifice vizibile internațional în reviste indexate Web of Science Core Collection (ISI/ESCI).

Rezulte etapa I

În perioada 01.09.2020 – 31.12.2020 a fost realizată etapa I a proiectului ce constă în determinarea profilului structural al inhibitorilor colagenazelor bacteriene.

În acest scop am folosit ca model colagenaza speciei Clostridium perfringens (strain 13/Type A), enzimă codificată CHEMBL2802 în baza de date a Institutului European de Bioinformatică (EMBL-EBI). Această resursă de date chimice şi bioinformatice (ChEMBL) a fost cercetată pentru identificarea tuturor compuşilor înregistrați ca inhibitori pe ținta CHEMBL2802. Din cele 253 de substanţe înregistrate, 239 de structuri posedă valori exacte ale parametrului Ki. Această colecție de compuși a fost analizată pentru relevarea caracteristicilor structurale relevante şi dezvoltarea de relații predictive între structura chimică şi potența inhibitorie asupra colageneazei, măsurată prin parametrul Ki.

Cu ajutorul software-ului DataWarrior au fost calculați o serie de descriptori moleculari, Caracteristicile structurale ale inhibitorilor fiind corelate succesiv cu valoare Ki în vederea obținerii unor relații între structura chimică și potenţialul de inhibare a colagenazelor bacteriene.

Concluzii: Toți compușii analizați conțin cel puțin 1 donor și cel puțin 8 acceptori de legături de hidrogen și cel puțin un inel aromatic, care este foarte adesea un benzen. Dimensiunea moleculei nu pare să influențeze în mod direct potența inhibiției. Au fost identificate și discutate o serie de grupe farmacofore: o-nitrobenzen, acid hidroxamic, sulfonamidă. Majoritatea inhibitorilor se bazează pe două structuri aromatice, fie două inele benzenice, fie un nucleu de benzen și un nucleu de naftalină, unite printr-o punte de cel puțin 3 atomi.

Prin urmare, elementele structurale evidențiate sunt foarte specifice, ceea ce face dificilă identificarea de noi candidați ca inhibitori de colagenază. Observarea relațiilor de bioizosterism între anumite fragmente structurale poate permite aplicarea unor modificări de analogie izosterică la proiectarea de noi inhibitori de colagenază.

Rezultate etapa II

În perioada 01.01.2021 – 31.12.2021 a fost realizată etapa II a proiectului ce a avut ca obiective:

• validarea compușilor ca inhibitori eficienți ai colagenazei
  • prin măsurarea inhibiției enzimatice cu ajutorul unei metode FRET
  • prin studii de docking molecular
• testarea in vivo a toxicității compușilor analizați cu ajutorul metodei ce utilizează nevertebratul Daphnia magna

Materiale și metode:

Determinarea activității inhibitorii asupra colagenazei a unor compuși naturali și de sinteză

A fost alcătuit un set de 88 de compuși naturali și de sinteză ce au fost testați pentru a determina capacitatea inhibitorie asupra colagenazei A din Clostridium histolyticum utilizând Kitul de analiză ab211108 Collagenase Inhibitor Assay Kit.  Acesta, alături de enzimă de interes, conține substratul reprezentat de gruparea fluorescentă BODIPY conjugată cu gelatină (tip B). Sub acțiunea enzimei, substratul eliberează gruparea BODIPY ce prezintă fluorescență, intensitatea acestei putând fi cuantificată. În cazul în care enzima este inhibată, aceasta nu mai poate scinda substratul, astfel observându-se o fluorescență mai scăzută. De asemenea, kittul conține și un inhibitor cunoscută al enzemei, 1,10-fenantrolina, utilizat ca mator.

Compușii au fost testați la o concentrație de 100 μM, în urma analizei 32 de compuși au prezentat capacitate de inhibiție superioară celei a 1,10-fenantrolinei 4000 μM, dovedindu-se a fi inhibitori potenți ai colagenazei A din C. histolyticum.

Analiza de docking molecular

Studiul de docking molecular a fost efectuat folosind algoritmul AutoDock Vina v1.1.2 construit în software-ul YASARA Structure. Secțiunea din proteină utilizată pentru andocare a inclus doar situsul activ din domeniul peptidază, care este format între două semi-domenii (helix central și helix gluzincin). Centrul catalitic al enzimei include ionul de Zn²⁺, care este complexat de doi aminoacizi histidină (HIS502 și HIS506) și doi aminoacizi glutamat (GLU503 și GLU534), aceștia funcționând ca stabilizatori ai histidinei. Astfel au fost analizați cei 32 de inhibitori identificați ca fiind potenți prin metoda in vitro în vederea stabilirii modalității de legare de enzimă.

In urma acestei analize au fost obținute: energia liberă de legare estimată pentru conformațiile cele mai favorabile, eficacitatea ligandului, aminoacizii implicați în legăturile ligandului cu enzima, precum și capacitatea ligandului de a se lega de ionul de Zn prezent în centrul catalic al colagenazei A din C. histolyticum pentru fiecare ligand în parte.

Evaluarea toxicităţii compușilor naturali și de sinteză prin modelul Daphnia

Principiul metodei constă în menținerea nevertebratelor Daphnia magna în diluții succesive obținute dintr-o substanță de testat și numărarea supraviețuitorilor după 24, respectiv 48 de ore; organismele care nu și-au mișcat membrele timp de 30 de secunde sunt considerate moarte. Cei 88 de compuși studiați au fost testați folosind acest model la concentrații de 100 μM, respectiv 50μM.

Au fost obținute valori procentuale ale letalității în funcţie de timpul de expunere şi de concentraţie pentru fiecare substanță.

Rezultate etapa III

În perioada 01.01.2022 – 15.11.2022 a fost realizată etapa a III-a a proiectului ce a avut ca obiective:

• determinarea concentrației inhibitorii 50%, respectiv concentrația la care compusul produce o scădere a activității colagenazei A de 50% raportat la martorul negativ (CI₅₀)
  • prin măsurarea inhibiției enzimatice cu ajutorul aceleiași metode FRET
• testarea microbiană a compușilor în vederea diferențierii efectului antivirulență de cel antimicrobian.

Determinarea CI₅₀ asupra colagenazei a compușilor analizați

32 de compușii ce au prezentat procente de inhibiție promițătoare în etapa a II-a, au fost testați în această etapă pentru a le determina CI₅₀. Pentru aceasta, compușii au fost testați la cinci concentrații, respectiv 100 µM, 50 µM, 10 µM, 5 µM și 1 µM.

Metodă

Determinările au fost realizate utilizând același tip de kit de analiză ab211108 Collagenase Inhibitor Assay Kit, iar protocolul de lucru a fost același.

Rezultate

În urma prelucrării datelor obținute prin analiza fluorimetrică am obținut un procent de inhibiție pentru fiecare compus raportat la martor pentru fiecare moment al testării.

S-a analizat evoluția cinetică a efectului inhibitor, analiză ce a permis identificarea inhibitorilor potenți.

Dintre cei 32 de compuși, pentru 16 s-a putut determinat CI_50. Astfel, pentru 6 compuși  CI_50. a fost estimat a fi mai mare de 100 µM,  7 compuși au CI₅₀ între 1 si 100 µM,  iar 3 compuși au CI₅₀ < 1 µM. Valorile CI₅₀ au fost calculate doar pentru 5 compuși deoarece pentru ceilalți fie nu au existat valori mai mici de 50%, fie nu au existat valori mai mari de 50%.

Evaluarea activității antimicrobiene a inhibitorilor de colagenază A

Obiectivul acestei determinări este de a selecta acei compuși ce nu au avut efect antimicrobian, dar care au avut efect inhibitor asupra colagenazei A in vitro.

Metode

Cei 16 compuși pentru care s-a putut determina CI₅₀ au fost testați pentru a le determina activitatea antimicrobiană prin metoda difuzimetrică și cea a microdiluțiilor pe opt tulpini bacteriene, atât gram pozitive cât și gram-negative, alese în funcție de sensibilitatea, respectiv rezistența acestora la diferite tipuri de antibiotice, dar și de disponibilitatea lor.

Dintre compușii analizați, 2 au prezentat efect inhibitor asupra unor tulpini Gram-pozitive și niciun compus nu a prezentat activitate antimicrobiană împotriva bacteriilor Gram-negative.

Concluzii finale

În perioada 01.09.2020 – 15.11.2022 activitatea de cercetare realizată în cadrul prezentului proiect a permis identificarea unor noi inhibitori ai colagenazei bacteriene, ca potențiali agenți antivirulență.

Prima etapă a fost reprezentată de studii in silico ce au permis identificarea caracteristicilor structurale optime ale unui bun inhibitor.

Pe baza rezultatelor obținute au fost selectați 88 de compuși din diverse clase chimice a căror activitate inhibitorie a fost testată prin metode in vitro, respectiv cu ajutorul unei analize fluorimetrice utilizând kitul de analiză ab211108 Collagenase Inhibitor Assay Kit în cea de a doua etapă. Suplimentar analizei fluorimetrice, a fost determinată toxicitatea compușilor cu ajutorul metodei ce utilizează nevertebratul Daphnia magna.

În urma testării preliminare 32 de compuși, ce au prezentat procente de inhibiție promițătoare, au fost retestați la diverse concentrații (100 µM, 50 µM, 10 µM, 5 µM și 1 µM) pentru a li se determina CI₅₀. Pentru 16 dintre aceștia s-a putut calcula CI_50, aceștia fiind compușii cărora li s-a evaluat activitatea antimicrobiană, deoarece scop a fost de a îi identifica pe cei fără efect bacteriostatic sau bactericid.

Astfel, 9 compuși au fost identificați ca inhibitori promițători ai colagenazei, dar, din păcate, 3 dintre aceștia au prezentat o toxicitate marcantă, cu o letalitate de 100% la 24 de ore pentru concentrația 50μM, iar piperina activitate antimicrobiană.

Totuși au existat 4 compuși cu CI₅₀ mai mic de 10 µM și care  au prezentat un profil toxicologic favorabil și nici nu au prezentat efect bacteriostatic sau bactericid. Astfel, datele noastre indică că această molecule ar putea fi utilizate împotriva infecțiilor cauzate de agenți patogeni bacterieni multi-rezistenți la medicamente care exprimă colagenaza A.

Diseminare:

1. Georgiana Nitulescu, George Mihai Nitulescu, Daniela Gradinaru. Structural profile of collagenase inhibitors, 7th International Electronic Conference on Medicinal Chemistry session Round table on predictive tools https://sciforum.net/paper/view/11489
2. Georgiana Nitulescu, George Mihai Nitulescu, Anca Zanfirescu, Dragos Paul Mihai, Daniela Gradinaru. Candidates for repurposing as anti-virulence agents based on the structural profile analysis of microbial collagenase inhibitors, Pharmaceutics 2022, 14(1), 62; https://doi.org/10.3390/pharmaceutics14010062
3. Georgiana Nitulescu, Dragos Paul Mihai, Anca Zanfirescu, Miruna Silvia Stan, Daniela Gradinaru, George Mihai Nitulescu. Discovery of new microbial collagenase inhibitors,  depus spre publicare la revista Life (factor impact: 3,251, Q2) – manuscris număr life-2047989