Sursa de finanțare: Unitatea Executivă pentru Finanțarea Învățământului Superior, a Cercetării, Dezvoltării și Inovării

Cod proiect: PN-III-P4-ID-PCE-2016-0641

Nr. Contractului: 183 PCE / 2017

Acronimul proiectului: CEACAMMEL

Titlul proiectului:
Caracterizarea mecanismelor ce implica CECAM-1 in melanom pe baza studiului regresiei tumorale, o abordare inovatoare pentru optimizarea managementului pacientilor cu melanom subtire

Descrierea proiectului – Rezumat:
Melanomul inregistreaza o crestere a incidentei totale, a incidentei la tineri si mortalitate ridicata. Variabilitatea extrema a evolutiei naturale si terapeutice, cu mortalitate inexplicabila a melanoamelor subtiri, clasificate in acelasi stadiu TNM, evidentiaza necesitatea unor noi biomarkeri utili ultrastadializarii.

Proiectul aduce in centrul atentiei molecula de adeziune celulara 1 a antigenului carcinoembrionar (CEACAM1), cheie in biologia tumorigenezei, in tranzitia epitelial-mezenchimala (responsabila pentru dobandirea capacitatii de metastazare) si eludarea sistemului imun (prin inhibarea functiilor limfocitelor din infiltratul tumoral).

In scopul elucidarii rolului CEACAM1 in modularea comportamentului agresiv al melanoamelor subtiri, am ales sa o studiem pentru prima data in melanomul cu regresie (MR) versus melanomul fara regresie (MfR), fenomenul de regresie reprezintand un model valoros pentru intelegerea imunologiei tumorale.

Ne propunem sa evaluam isoformele moleculei CEACAM1 folosind teste de imunohistochimie (IHC), RT-PCR si Western blot in MR si MfR subtiri si ELISA pentru testele serice. Vom efectua studii retrospective (tesut tumoral de la 90 MR, 90 MfR, 30 nevi cu halou si 30 nevi comuni (control)) si studii prospective (plasma, tesut tumoral proaspat inghetat si la parafina de la 30 MR subtiri, 30 MfR subtiri, 10 nevi cu halou si 30 de nevi comuni). Am format o echipa multidisciplinara, alcatuita din cercetatori seniori si juniori sub indrumarea unui cercetator extrem de experimentat, cu vasta expertiza in IHC enzimatica, cu fluorescenta si analize complexe morfometrice.

Vom analiza corelatia dintre disfunctia CEACAM1, prognostic, infiltratul inflamator tumoral si markeri tisulari de progresie consacrati.

Aceasta abordare va clarifica mecanismele prin care CEACAM1 este implicat in progresia si regresia melanoamelor subtiri, ca punct de pornire pentru o noua stratificare a riscului melanoamelor incipiente si o conduita terapeutica adecvata.

Echipa proiectului:
Coordonator (CO): Universitatea de Medicină și Farmacie “Carol Davila” București
Director de proiect: Prof. Dr. Nicolae Daniel Pirici

Obiectivul proiectului:
Obiectivul nostru principal este de a stabili rolul izoformelor CEACAM1 în invazivitatea și agresivitatea melanoamelor subțiri. Pentru a realiza acest obiectiv, vom evalua variatiile expresiei izoformelor CEACAM1 în celulele tumorale și inflamatorii în melanomul cu regresie (RM) și fara regresie (nRM) comparativ cu nevii cu halou și nevii comuni.

Având în vedere design-ul studiului nostru, vor fi îndeplinite mai multe obiective secundare specifice:

• -elucidarea mecanismelor care implică CEACAM1 în răspunsul inflamator în melanoamele subțiri
• identificarea mecanismelor fiziopatologice prin care CEACAM1 este implicat în regresia / progresia tumorii și evaluarea nivelului său seric ca biomarker pentru progresia melanoamelor subțiri
• obtinerea de noi perspective asupra mecanismelor implicate in raspunsul imun al gazdei in RM si nRM versus control si corelarea ulterioara cu alte molecule de adeziune celulara si markeri ai EMT
• stabilirea particularităților relației dintre expresia CEACAM1 și diferitele tipuri de răspunsuri imune în RM și nRM subțire față de control
• stabilirea unui nou criteriu / criterii pentru clasificarea suplimentară a melanoamelor subțiri.

Rezultatele estimate:
Pentru a obtine rezultatele preconizate, ne-am structurat activitatea în șase pachete de lucru. Rezultatele estimate sunt:

• Rapoartele anuale (M12, M24) și Raportul final (M 30) - incluzand raportul științific și financiar;
• Raport de cercetare privind exprimarea CEACAM1 în melanoamele RM și nRM față de control (M24);
• Raport de cercetare privind corelație între expresia CEACAM1 și markerii de țesut consacrati legate de progresie în melanomul cu și fără regresie față de control (M24);
• Nivelurile izoformelor de CEACAM1 în plasmă și țesut în relație cu agresivitatea melanomului (M24);
• Raport științific privind mecanismele care implică CEACAM1 în melanom (M30);
• Trei lucrări științifice (M12, 24, 30) și trei prezentări (M12, 24, 30)

Data începerii proiectului: 12/07/2017

Data încheierii proiectului: 31/12/2019

Durata proiectului (luni): 30

Valoarea totala de la buget: 850.000,00 lei

Valoarea totala cofinantare: 0 lei

Etapa 1/2017

Rezumat Faza I

Etapa 1 a proiectului include activitățile de management și diseminare, task-urile 1 și 2 din cadrul WP2 precum și task-ul 1 din cadrul WP4.

Membrii echipei de cercetare au stabilit sa comunice online la intervale regulate (1/săpt) și sa redacteze in scris memo-urile și procesele verbale ale discuțiilor.

Pentru o mai eficienta supervizare a desfășurării proiectului se utilizează grafice Gantt; a fost efectuat planul de activități defalcat, cu precizarea subactivităților, responsabilităților și termenelor intermediare și finale, stabilirea eficientă și echitabilă a rolurilor, atribuțiilor și responsabilităților în cadrul echipei de cercetare. 

1.WP1: Management

1.1 Crearea suportului IT al bazei de date a pacienților; inițierea înregistrării pacienților în baza de date

Baza de date a fost realizată în conformitate cu literatura recentă, cu studiile asemănătoare și cu necesitățile informaționale ale proiectului, astfel încât să permită accesul rapid la informații complete despre pacient, la pozele clinice, dermatoscopice, histopatologice.

1.2 Crearea și implementarea paginii de web a studiului

Toate informațiile privind stadiul actual al proiectului, detalii actualizate despre obiectivele proiectului, despre membrii echipei de cercetare și planul de activitate pentru anul 2018 vor fi  actualizate pe pagina de web a proiectului.

 1.3 Studiul bibliografiei fizice, electronice si online; crearea bazei de date bibliografice

Au fost analizate bazele de date științifice naționale și internaționale: Medline, PubMed, ScienceDirect, Thomson ISI.

Au fost selectate publicațiile peer-reviewed pe temele: molecule de adeziune celulară, CEACAM1, regresia în melanom, rolul celulei dendritice în regresia melanocitară, acordand prioritate articolelor din ultimii 5 ani din publicații de prestigiu (Ex: British Journal of Dermatology, Journal of the American Academy of Dermatology, Archives of Dermatological Research, Nature Biotechnology, Skin Research and Technology).

S-a realizat baza de date bibliografice, cuprinzând aproximativ 100 de articole full text, alături de care abstracte și documente ale principalelor conferințe internaționale din ultimii 3 ani pe temele de interes: dermatooncologie, dermatopatologie, biologie moleculară, imunohistochimie, dermatoscopie.

A fost realizat un studiul scientometric comprehensiv pentru identificarea tendințelor (de la nivel mondial) în cercetarea științifică și practica medicală asociat cu obiectivele proiectului. Metodologia scientometrică operaționalizată a presupus utilizarea combinată a două instrumente software de analiză semantică (Tropes Zoom) și analiză de rețea (Gephi). Instrumentul de analiză semantică integrează două modele de lucru - analiza propozițională a discursului și analiza predicativă propozițională.

Corpusul de texte analizate a fost compus din abstractele a 19.024 de articole științifice înregistrate în PubMed (883 de articole care conțin termenul cheie „CEACAM1”, publicate în perioada 1981-2017 și 18.141 de articole care conțin termenul cheie „melanoma” publicate în ultimii trei ani).

Operaționalizarea analizei semantice a presupus construcția unui dicționar (scenariu de analiză) arborescent cu 18 clase semantice cu 61 de subclase și 231 de cuvinte cheie.

Instrumentul software de analiză semantică permite exportul ontologiei semantice în format compatibil cu Gephi - care permite procesări matematice și statistice suplimentare, relevante pentru analiza scientometrică.

 2.WP2: Expresia izoformelor CEACAM1 si corelarea cu raspunsul inflamator in melanomul cu regresie (RM), respectiv in melanomul fara regresie (nRM)

2.1 Asamblarea blocurilor multitisulare din grupul A (WP2, task 1)

Din arhiva Serviciului de Anatomie Patologică al Spitalului Clinic Colentina au fost selecționate 45 de cazuri de pacienți diagnosticați histopatologic cu melanom malign subțire (≤ 2mm, corespunzător stadiilor pTis, pT1, pT2).

S-au identificat datele clinice şi de urmărire ale pacienţilor din foile de observaţie ale acestora: sex, vârstă, localizare, dimensiuni.

Din punct de vedere histopatologic, s-a urmărit prezența factorilor prognostici consacraţi sau în curs de validare: indice Breslow, nivel Clark, invazie în diferitele structurile normale adiacente, ulceraţie, invazie vasculară, invazie perineurală, infiltrat inflamator intratumoral, index mitotic, prezența ariilor de regresie, prezenţa nodulilor sateliţi/ a metastazelor în tranzit, a metastazelor limfoganglionare, a metastazelor viscerale, a leziunilor nevice asociate.

S-au reexaminat lamele colorate hematoxilină-eozină și s-au identificat ariile de interes din punct de vedere histopatologic, care s-au secționat și inclus manual în blocuri multitisulare (BMT).

Din fiecare BMT s-au efectuat secțiuni cu grosime de 3 microni care au fost etalate pe lame cu polilizina în vederea efectuării de teste imunohistochimice (IHC) pentru CEACAM1, N-caderina, E-caderina, β-catenin, TGF-β, MMP, TIMP, p53, p16, p21, Ki67, fas, VEGF.

De asemenea, în vederea pregătirii celei de-a doua etape de implementare a proiectului, au fost consultate articole din literatura de specialitate privind expresia tisulară și izoformele CEACAM.

S-au obtinut blocuri multitisulare si lamele corespunzatoare colorate hematoxilină-eozină.

Prelucrarea datelor obținute din consultarea arhivei și din examinarea lamelor a relevat următoarele date:

• lotul actual include 19 bărbați și 26 de femei cu vârste cuprinse între 26 și 84 de ani (vârsta medie este de 55 ani);
• indicele Breslow (factor important de pronostic și în subgrupul melanoamelor subțiri [2]) minim a fost 0,20mm (cel maxim fiind ales 2mm), 14 leziuni (31% din total) având Breslow cuprins între 0,20 și 1mm, restul fiind mai subțiri de 1mm.
• 14 leziuni au prezentat regresie tumorală, paisprezece ulcerație, patru invazie vasculară. Invazia neurală a fost absentă pe toate leziunile examinate.

2.2. Exprimarea izoformelor CEACAM1 în melanoamele MR și nMR față de grupul control (WP2, Task 2)

S-a efectuat o documentare ampla privind expresia izoformelor CEACAM1 în melanoamele MR și nMR.

In baza acestei documentari, s-a decis ca, pentru analizarea expresiei CEACAM1 ca element-cheie al mecanismelor imunologice implicate în progresia/ regresia melanoamelor subțiri, sa se efectueze teste imunohistochimice și o evaluare serologică a moleculelor de adeziune celulară. Expresia CEACAM1 va fi corelată cu markerii tisulari consacrați în progresia melanomului subțire, utilizând nevii benigni drept grup control.

3.Colectarea probelor biologice (țesuturi proaspete și ser) (WP4, task 1)

Consimțămintele și aprobările au fost întocmite în conformitate cu normele eticii cercetării și practicii medicale, a normelor internaționale OMS, UE și legislației naționale.

A fost înrolat un caz în studiul prospectiv căruia i s-au explicat procedurile, ulterior semnând consimțământul. Pentru acesta s-a respectat un protocol prestabilit de prelevare a produselor biologice pentru analizele ce se efectuează la Institutul de Virusologie.

S-a recoltat sange care a fost transportat la Instititul de Virusologie, unde probele au fost centrifugate și alicotate, apoi depozitare la -80°C.

Pentru obtinerea probelor tisulare tumorale, după excizia chirurgicală, tumora a fost transportată  la laboratorul de anatomie patologică, unde s-a tăiat un fragment de circa 10mg, fragmentul fiind apoi depozitat la -80°C.

Pentru realizarea unei baze de date cât mai mari, astfel încat rezultatele obținute să aibă valoare statistică, s-au stabilit colaborări cu medici de familie, medici specialiști din Spitalul Universitar de Urgență Elias și Spitalul Clinic Colentina, precum și alte unități medicale, în vederea îndrumării pacienților pentru evaluare gratuită, clinică, dermatoscopică și prin tomografie optică a leziunilor cutanale premaligne și maligne. Aceștia au fost înștiințați cu privire la obiectivele studiului de stabilire a performanțelor diferitelor metode imagistice în detectarea precoce a neoplaziilor cutanate și cu privire la faptul că informațiile obținute le vor fi puse la dispoziție în vederea stabilirii planului de îngrijire ulterioară.

4. Diseminarea rezultatelor cercetării

Obiectivele fazei au fost îndeplinite în totalitate, cu realizarea rezultatelor prevazute în planul de activități.

Rezultatele preliminare ale activităților de cercetare derulate au fost incluse în trei lucrari prezentate la conferințe internaționale și patru lucrări prezentate la Congresul Național de Dermatologie - cu participare internațională. Dupa studierea literaturii actuale de specialitate și primele studii, au fost elaborate două articole, dintre care unul este deja publicat într-o revistă indexată BDI[1], iar cel de-al doilea a fost trimis spre publicare și a fost aceptat, urmând să fie publicat în primul trimestru al anului 2018.

Congresul anual al Academiei Europene de Dermatologie și Venereologie reprezintă un eveniment științific prestigios pentru dermatologii europeni, ce are ca și obiectiv promovarea excelenței în cercetare, îngrijirea clinică și educație medicală continuă. Lucrarile prezentate la Geneva  au fost elaborate de membrii echipei de cercetare, pornind de la cazuistica evaluată în cadrul etapei de includere a pacienților în studiu.

În cadrul Congresului Național de Dermatologie, desfăsurat în Brașov în octombrie, membrii echipei au prezentat colegilor din țară o serie de cazuri relevante pentru patologia tumorală de interes.

Analiza scientometrică va fi integrată într-unul dintre articolele științifice planificate pentru următoarea etapă de implementare a proiectului.

Diseminare

Articole acceptate spre publicare în reviste indexate BDI:

Stîngă Patricia-Irina, Stoica Alina, Cioplea Mirela Daniela, Zurac Sabina, Nichita Luciana, Popp Cristiana, Cioroianu Alexandra Ioana, Bastian Alexandra Eugenia. SPITZOID MELANOMA-CASE REPORT; POTENTIAL ROLE OF ALK EXPRESSION IN THE DIAGNOSIS OF SPITZOID MELANOCYTIC LESIONS - Romanian Journal of Clinical and Experimental Dermatology

Conferințe:

Balmes G., Todorovic T., Zurac S., Brinzea A., Nedelcu R., Turcu G. Nodulul sister Mary Joseph - Congresul National de Dermatologie 2017, Brasov, Romania, De la 04/10/2017 Pâna la 07/10/2017

Balaban M., Brinzea A., Turcu G., Ion D.A., Zurac S., Cioplea M.D., Stoica A., Popescu R., Popescu C., Antohe M., Nedelcu R. Epiteliomul calcificat Malherbe la nivel facial - Congresul National de Dermatologie 2017, Brasov, Romania, De la 04/10/2017 Pâna la 07/10/2017

Balaban M., Turcu G., Brinzea A., Ion D.A., Zurac S., Stoica A., Cioplea M.D., Popescu R., Popescu C., Antohe M., Nedelcu R. Dermatofibrosarcoma protuberans Darier-Ferrand: raportare de caz - Congresul National de Dermatologie 2017, Brasov, Romania, De la 04/10/2017 Pâna la 07/10/2017

Brinzea A., Popescu R., Popescu C., Hodorogea A., Balaban M., Calinescu A., Nedelcu R., Turcu G., Ion D.A., Antohe M., Ionescu M., Teodorescu C., Vacarelu C., Gosa R., Balaban M. Aspecte dermatoscopice în epiteliomul bazocelular pigmentat vs. nepigmentat - Congresul National de Dermatologie 2017, Brasov, Romania, De la 04/10/2017 Pâna la 07/10/2017