PN-III-P1-1.1-PD-2019-0646: Identificarea de noi inhibitori de colagenază bacteriană ca medicamente antivirulență (COLINA)

Denumirea proiectului: Identificarea de noi inhibitori de colagenază bacteriană ca medicamente antivirulență

Contract Nr.: PD 184/2020

Cod Proiect: PN-III-P1-1.1-PD-2019-0646

Tip proiect: PN-III-P1-1.1-PD (Proiecte de Cercetare Postdoctorală)

Finanțare de la bugetul de stat: 236.966 lei

Durata de desfășurare proiect: 01.09.2020 - 31.08.2022 (24 luni)

Echipa de cercetare:

Director proiect: Dr. Georgiana Nițulescu, Asistent universitar la Disciplina Tehnologie farmaceutică și Biofarmacie, Facultatea de Farmacie, UMF Carol Davila

Mentor: Dr. Daniela Grădinaru, Profesor universitar la Disciplina Biochimie, Facultatea de Farmacie, UMF Carol Davila

Obiectivul proiectului: Identificarea unor inhibitori ai colagenazelor bacteriene, enzime implicate în virulența tulpinilor de Clostridium, P.aeruginosa, precum și a altor bacterii capabile să secrete aceste enzime. Acești inhibitori reprezintă posibile soluții terapeutice pentru tratamentul infecțiilor nosocomiale cu agenți patogeni foarte rezistenți.

Metodologie și plan de lucru:

Etapa I (01.09.2020 – 31.12.2020): Identificarea profilului molecular al inhibitorului enzimatic cu ajutorul tehnicilor moderne de cercetare a medicamentului precum screening virtual.

Etapa II (01.01.2021 – 31.12.2021): Validarea compușilor ca inhibitori eficienți ai anti-colagenazei prin studii de docking molecular și determinarea in vitro a inhibiției enzimatice. Studii de evaluare toxicologică a compușilor.

Etapa III (01.01.2022 – 31.08.2022): Evaluarea inhibitoare a colagenazei în culturile bacteriene.

Rezultate estimate: Identificarea profilului structural optim al inhibitorilor de colagenază bacteriană dar și evidențierea efectului de inhibiție al colagenazei bacteriene pentru diverși compuși testați. În această direcție este avută în vedere publicarea a cel puțin două articole științifice vizibile internațional în reviste indexate Web of Science Core Collection (ISI/ESCI).

Rezulte etapa I

În perioada 01.09.2020 – 31.12.2020 a fost realizată etapa I a proiectului ce constă în determinarea profilului structural al inhibitorilor colagenazelor bacteriene.

În acest scop am folosit ca model colagenaza speciei Clostridium perfringens (strain 13/Type A), enzimă codificată CHEMBL2802 în baza de date a Institutului European de Bioinformatică (EMBL-EBI). Această resursă de date chimice şi bioinformatice (ChEMBL) a fost cercetată pentru identificarea tuturor compuşilor înregistrați ca inhibitori pe ținta CHEMBL2802. Din cele 253 de substanţe înregistrate, 239 de structuri posedă valori exacte ale parametrului Ki. Această colecție de compuși a fost analizată pentru relevarea caracteristicilor structurale relevante şi dezvoltarea de relații predictive între structura chimică şi potența inhibitorie asupra colageneazei, măsurată prin parametrul Ki.

Cu ajutorul software-ului DataWarrior au fost calculați o serie de descriptori moleculari, Caracteristicile structurale ale inhibitorilor fiind corelate succesiv cu valoare Ki în vederea obținerii unor relații între structura chimică și potenţialul de inhibare a colagenazelor bacteriene.

Concluzii: Toți compușii analizați conțin cel puțin 1 donor și cel puțin 8 acceptori de legături de hidrogen și cel puțin un inel aromatic, care este foarte adesea un benzen. Dimensiunea moleculei nu pare să influențeze în mod direct potența inhibiției. Au fost identificate și discutate o serie de grupe farmacofore: o-nitrobenzen, acid hidroxamic, sulfonamidă. Majoritatea inhibitorilor se bazează pe două structuri aromatice, fie două inele benzenice, fie un nucleu de benzen și un nucleu de naftalină, unite printr-o punte de cel puțin 3 atomi.

Prin urmare, elementele structurale evidențiate sunt foarte specifice, ceea ce face dificilă identificarea de noi candidați ca inhibitori de colagenază. Observarea relațiilor de bioizosterism între anumite fragmente structurale poate permite aplicarea unor modificări de analogie izosterică la proiectarea de noi inhibitori de colagenază.

Rezultate etapa II

În perioada 01.01.2021 – 31.12.2021 a fost realizată etapa II a proiectului ce a avut ca obiective:

  • validarea compușilor ca inhibitori eficienți ai colagenazei
    • prin măsurarea inhibiției enzimatice cu ajutorul unei metode FRET
    • prin studii de docking molecular
  • testarea in vivo a toxicității compușilor analizați cu ajutorul metodei ce utilizează nevertebratul Daphnia magna

Materiale și metode:

Determinarea activității inhibitorii asupra colagenazei a unor compuși naturali și de sinteză

A fost alcătuit un set de 88 de compuși naturali și de sinteză ce au fost testați pentru a determina capacitatea inhibitorie asupra colagenazei A din Clostridium histolyticum utilizând Kitul de analiză ab211108 Collagenase Inhibitor Assay Kit.  Acesta, alături de enzimă de interes, conține substratul reprezentat de gruparea fluorescentă BODIPY conjugată cu gelatină (tip B). Sub acțiunea enzimei, substratul eliberează gruparea BODIPY ce prezintă fluorescență, intensitatea acestei putând fi cuantificată. În cazul în care enzima este inhibată, aceasta nu mai poate scinda substratul, astfel observându-se o fluorescență mai scăzută. De asemenea, kittul conține și un inhibitor cunoscută al enzemei, 1,10-fenantrolina, utilizat ca mator.

Compușii au fost testați la o concentrație de 100 μM, în urma analizei 32 de compuși au prezentat capacitate de inhibiție superioară celei a 1,10-fenantrolinei 4000 μM, dovedindu-se a fi inhibitori potenți ai colagenazei A din C. histolyticum.

Analiza de docking molecular

Studiul de docking molecular a fost efectuat folosind algoritmul AutoDock Vina v1.1.2 construit în software-ul YASARA Structure. Secțiunea din proteină utilizată pentru andocare a inclus doar situsul activ din domeniul peptidază, care este format între două semi-domenii (helix central și helix gluzincin). Centrul catalitic al enzimei include ionul de Zn2+, care este complexat de doi aminoacizi histidină (HIS502 și HIS506) și doi aminoacizi glutamat (GLU503 și GLU534), aceștia funcționând ca stabilizatori ai histidinei. Astfel au fost analizați cei 32 de inhibitori identificați ca fiind potenți prin metoda in vitro în vederea stabilirii modalității de legare de enzimă.

In urma acestei analize au fost obținute: energia liberă de legare estimată pentru conformațiile cele mai favorabile, eficacitatea ligandului, aminoacizii implicați în legăturile ligandului cu enzima, precum și capacitatea ligandului de a se lega de ionul de Zn prezent în centrul catalic al colagenazei A din C. histolyticum pentru fiecare ligand în parte.

Evaluarea toxicităţii compușilor naturali și de sinteză prin modelul Daphnia

Principiul metodei constă în menținerea nevertebratelor Daphnia magna în diluții succesive obținute dintr-o substanță de testat și numărarea supraviețuitorilor după 24, respectiv 48 de ore; organismele care nu și-au mișcat membrele timp de 30 de secunde sunt considerate moarte. Cei 88 de compuși studiați au fost testați folosind acest model la concentrații de 100 μM, respectiv 50μM.

Au fost obținute valori procentuale ale letalității în funcţie de timpul de expunere şi de concentraţie pentru fiecare substanță.

Concluzii

În urma screeningului biologic s-au putut identifica 32 de compuși ce prezintă efect inhibitor asupra colagenazei A din C. histolyticum, iar studiile de docking molecular au contribuit la corelarea activității inhibitorii cu mecanismul lor de acțiune.

Studiile de toxicitate folosind crustaceul Daphnia magna au permis conturarea unui profil de toxicitate acută pentru toți compușii.

Astfel, obiectivul acestei etape a fost realizat, iar prin coroborarea rezultatelor s-au putut evidenția inhibitori potenți ai colagenazei bacteriene cu toxicitate redusă.

Dintre cei 88 de compuși testați, cel mai mare efect inhibitor îl are curcumina (112,73%), inhibiția asupra colagenazei menținându-se pe durata determinării. Profilul de toxicitate al curcuminei obținut prin testul Daphnia magna este unul favorabil, acesta prezentând o toxicitate de 10% (50μM) și 70% (100μM) la 24 de ore, respectiv de 20% (50μM) și 90% (100μM) la 48 de ore.

Din grupul derivaților flavonici s-au evidențiat: 3-hidroxiflavona, miricetina, 4’,5-dihidroxiflavona, izoramnetina, biochanina A și miricitrina ca inhibitori de colagenază potenți, iar analiza profilelor toxicologice obținute a permis identificarea miricetinei și a miricitrinei ca inhibitori de colagenază cu toxicitate scăzută.

Compusul juglonă a avut un efect de inhibiție asupra colagenază mult mai bun față de cel al derivaților flavonici, dar, din păcate și o toxicitate superioară asupra crustacelului Daphnia magna.

Diseminare:

  1. Georgiana Nitulescu, George Mihai Nitulescu, Daniela Gradinaru. Structural profile of collagenase inhibitors, 7th International Electronic Conference on Medicinal Chemistry session Round table on predictive tools https://sciforum.net/paper/view/11489
  2. Georgiana Nitulescu, George Mihai Nitulescu, Anca Zanfirescu, Dragos Paul Mihai, Daniela Gradinaru. Candidates for repurposing as anti-virulence agents based on the structural profile analysis of microbial collagenase inhibitors, depus spre publicare la revista Pharmaceutics (factor impact: 6,321, Q1) – manuscris număr pharmaceutics-1520555
TOP